凈信研磨儀和真空離心濃縮儀助力---探討小鼠急性肺損傷機制

題目：基于花生四烯酸代謝途徑探討炎調(diào)方治療脂多糖所致急性肺損傷的機制

作者：李鵬程，陳天陽，方榮，張安娜，吳思佳，劉偉，王倩

DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20241016

急性肺損傷（ALI）是一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床特征表現(xiàn)為呼吸急促、呼吸困難、嚴(yán)重者可出現(xiàn)頑固性低氧血癥、急性呼吸窘迫綜合征，有較高的發(fā)病率和致死率。直至今日，仍然沒有治療急性肺損傷的特效藥，然而科學(xué)家對該疾病的研究從未停止。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院王倩博士帶領(lǐng)的研究團隊在研磨儀和真空離心濃縮儀的助力下進行小鼠急性肺損傷機制的探究。

相關(guān)實驗

正常組小鼠6只，模型組小鼠6只（腹腔注射脂多糖LPS溶液建立小鼠 ALI 模型），給藥組：地塞米松組（2 mg·kg-1）、炎調(diào)方低劑量組（18 g·kg-1）、炎調(diào)方高劑量組（36 g·kg-1）各6只。

花生四烯酸（AA）類代謝物檢測樣品制備

?血清 AA 樣品制備

取血清 30 μL，置于 1.5 mL 離心管，加混合液（甲醇：乙腈，1:1，v/v）150 μL，蓋好蓋 子后渦旋震蕩 30 s，使蛋白質(zhì)變性沉淀，在 4 ℃，15 000 r·min-1 離心 10 min，取上清 144 μL 置于新的 1.5 mL 離心管中，真空離心濃縮儀吹干；加入混合液（水：甲醇：乙腈，2:1:1，v/v）60 μL 至吹干的離心管中，渦旋震蕩 60 s，使干燥殘渣復(fù)溶，在 4 ℃，15 000 r·min-1 離心 10 min，取上清 50 μL 置內(nèi)襯管中，進液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS/MS）分析， 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

Fig2（Nat. Plants，2024）

?肺組織AA樣品制備

準(zhǔn)確稱取肺組織 30 mg 置于 1.5 mL 離心管，加入混合液（甲醇：乙腈，1:1，v/v）600 μL， 放入 2 顆研磨珠，使用研磨儀，65 Hz，研磨 1 min，研磨2 次。

將研磨后的勻漿液在 4 ℃，15 000 r·min-1 離心 10 min，取上清 480 μL 置于新的 1.5 mL 離心管中，用真空離心濃縮儀吹干。加入混合液（水：甲醇：乙腈，2:1:1，v/v）96 μL 至吹干的 離心管中，渦旋震蕩 60 s，使干燥殘渣復(fù)溶，在 4 ℃，15 000 r·min-1 離心 10 min，取上清 80 μL 置于內(nèi)襯管中，進 LC-MS/MS 分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

?色譜條件

采用 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相 A（0.1%甲酸水）- 流動相 B（乙腈），梯度洗脫（0~10 min，48%~75%B；10~10.1 min，75%~90%B；10.1~12 min，90%B；12~12.1 min，90%~48%B；12.1~14 min，48%B）；進樣量為 3 μL，體積流量為 0.25 mL·min-1，柱溫恒定為 36 ℃，總離子流圖如下

注：A.對照品；B.血清；C.肺組織；1.PGE2；2. PGD2；3. 15-HETE；4. 11(S)-HETE；5. 5-HETE；6. 14,15-EET；7. 11,12-EET；8. 8,9- EET

圖 1 花生四烯酸類代謝物檢測總離子流色譜

通過對正常組、模型組和給藥組小鼠肺組織中花生四烯酸（AA）類代謝物對比分析，炎調(diào)方可影響 AA 在體內(nèi)的 3 條主要代謝途徑，通過降低血清和肺組織中促炎類代謝產(chǎn)物的含量，以及提高血清和肺組織中 11,12-EET 的含量而發(fā)揮廣泛的抗炎作用，從而減輕 LPS 所致 ALI。通過研磨儀研磨樣本，把目標(biāo)物質(zhì)釋放，加入試劑提取，然后用真空離心濃縮儀濃縮，濃縮后的樣本可進行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析。研磨儀和真空離心濃縮儀的配合使用，使GC-MS/LC-MS分析更方便，上機檢測前處理更簡單，更快捷。

文中所用儀器

真空離心濃縮儀

真空離心濃縮儀可用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的樣品制備和分析，在生命科學(xué)領(lǐng)域中，真空離心濃縮儀常用于分離和濃縮蛋白質(zhì)、核酸和其他生物分子。真空離心濃縮是一種將溶劑蒸發(fā)出去以濃縮或干燥生物(非生物)樣品的過程。采用離心力、真空和加熱相結(jié)合的方法使樣品中的溶劑快速蒸發(fā)，從而達到濃縮樣品的目的，方便后續(xù)實驗的分析和檢測。

高通量組織研磨儀

高通量組織研磨儀能將任何來源(包括土壤、植物和動物的組織/器官、細(xì)菌、酵母、真菌、孢子、古生物標(biāo)本等)的原始DNA、RNA和蛋白質(zhì)進行提取和純化。

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